Журнал физической химии и биофизики
Открытый доступ
ISSN: 2161-0398
ISSN: 2161-0398
Карстен Цайлингер
MjK2 был экспрессирован в клетках E. coli как белок слияния, содержащий сайт связывания антитела на N- или C-конце и гексамер гистидина. Белок слияния с C-концевой меткой позволяет экспрессировать и очищать дополнительный растворимый домен RCK при p34 кДа, тогда как этот дополнительный домен RCK терялся при использовании конструкции с N-концевой меткой. После удаления пептида слияния из очищенного мономера канала с N-концевой меткой MjK2 появлялся в виде стабильного тетрамера при инкубации с синтетическим липидом. Активность канала изучалась после восстановления в липосомах с помощью одноканальной записи или с помощью оптического анализа с использованием красителя, чувствительного к калию, PBFI. Сначала функция канала была улучшена с помощью одноканальной записи. Одноканальная запись подтвердила зависимость активности канала от pH с одноканальной проводимостью 42, 70, 85 и 202 пСм и показала, что был сформирован функциональный канал K+. Для изучения функции активности восстановленного MjK2 в оптическом анализе высвобождение калия инициировалось, когда внешний блок BaCl2 компенсировался добавлением ЭДТА. Высвобождение калия опосредовалось восстановленным MjK2 при низком pH или присутствием внутреннего кальция при высоком pH. MgCl2 не оказывал никакого эффекта или оказывал слабое действие, тогда как цАМФ при низком pH вызывал полную потерю калия во время приготовления. Исследования выравниваний показали, что MjK2 имеет различные структурные особенности в поре канала и составе RCK, и поэтому можно ожидать другую функцию. Аминокислотная последовательность и структурные выравнивания показали, что сайт связывания Ca2+ и типичный сайт связывания нуклеотидов отсутствуют в домене RCK MjK2, и поэтому можно ожидать другого поведения. Кроме того, область линкера лизинового хребта, обнаруженная в каналах K+ человеческой спермы hslo1 и hslo3, может играть аналогичную роль в поведении гейтинга.