Достижения в области генной инженерии
Открытый доступ
ISSN: 2169-0111
ISSN: 2169-0111
Cédric Happi Mbakam
Мутации в гене дистрофина приводят к нервно-мышечным расстройствам, таким как мышечная дистрофия Дюшенна, которая является летальным наследственным заболеванием, сцепленным с Х-хромосомой, с распространенностью 19,8 на 100 000 новорожденных мужчин. Доступные в настоящее время клинические методы лечения с использованием кортикостероидов или инъекций морфолино антисмысловых олигомеров обеспечивают ограниченное фенотипическое улучшение. Наше исследование было направлено на измерение эффективности технологии редактирования PRIME. Эта технология использует плазмиду-редактор PRIME (PE2 или PE3), кодирующую обратную транскриптазу вируса лейкемии мышей Молони, слитую с никазой Cas9 H840A, и плазмиду, кодирующую pegRNA, содержащую сайты связывания праймера (PBS) и шаблон обратной транскриптазы (RTT). Он допускает специфические замены нуклеотидов, делеции или вставки в геноме. Мы разработали различные pegRNA, нацеленные на несколько hDMDexons (9, 20, 35, 43, 51, 55 и 61), чтобы ввести STOP-кодон путем модификации одного нуклеотида. Клетки HEK293T были собраны из культуральной среды DMEM через три дня после одновременной трансфекции PE2 и pegRNA. Экзоны были амплифицированы ПЦР и секвенированы с использованием метода Сэнгера. Результаты были проанализированы с использованием программы EditR для оценки процента редактирования. Мы подтвердили, что редактирование PRIME допускает специфические замены C на T и G на T в гене DMD с эффективностью редактирования от 6 до 11 % (PE2) и 21 % (PE3). Повторные трансфекции через 6 дней после первой показали до 15 % (PE2) редакции в экзонах 9 и 35. Дополнительная мутация в последовательности PAM (экзон 35) улучшила результат PE2 до 38% для одной трансфекции. Таким образом, редактирование PRIME позволяет вносить специфические замены в ген DMD и может использоваться для исправления точечных мутаций в гене DMD, приводящих к экспрессии дистрофина.