Журнал гликомики и липидомики
Открытый доступ

Абстрактный

Аланин усиливает продукцию активных форм кислорода, вызванную аминогликозидами, посредством метаболической регуляции

Jinzhou Ye

Уничтожение антибиотикорезистентных патогенов антибиотиками с помощью метаболитов является привлекательной стратегией для управления устойчивостью к антибиотикам. Наше предыдущее исследование показало, что аланин и/или глюкоза повышают эффективность уничтожения канамицином антибиотикорезистентных бактерий, действие которого осуществляется посредством повышения регуляции цикла TCA, увеличения движущей силы протонов и усиления поглощения антибиотиков. Несмотря на то, что аланин изменяет несколько  метаболических путей , в уничтожении бактерий канамицином, опосредованном аланином, могут быть потенциально задействованы и другие механизмы, которые еще предстоит изучить. В настоящем исследовании мы приняли протеомный подход для анализа изменений протеома, вызванных экзогенным аланином. Наши результаты показали, что экспрессия трех белков внешней мембраны была изменена, а удаление nagE и fadL снизило внутриклеточную концентрацию канамицина, что подразумевает их возможную роль в опосредовании транспорта канамицина. Что еще более важно, комплексный анализ протеомных и метаболомных данных указал на то, что метаболизм аланина может быть связан с метаболизмом рибофлавина, который является источником продукции активных форм кислорода (ROS). Функциональные исследования подтвердили, что  лечение аланином  вместе с канамицином может способствовать выработке ROS, что в свою очередь усиливает уничтожение бактерий, устойчивых к антибиотикам. Дальнейшие исследования показали, что аланин подавляет транскрипцию генов, кодирующих антиоксиданты, и метаболизм аланина в метаболизм рибофлавина, связанный с метаболизмом рибофлавина через цикл трикарбоновых кислот, путь глюкогенеза и путь пентозофосфата. Наши результаты предполагают новый механизм, с помощью которого аланин облегчает уничтожение канамицином  бактерий, устойчивых к антибиотикам,  посредством стимулирования выработки ROS. Широкое распространение бактерий, устойчивых к антибиотикам, является растущей проблемой, представляющей катастрофическую угрозу для людей в каждой стране мира. Контроль бактерий, устойчивых к антибиотикам, становится неотложной проблемой для общества. Хотя государственные вмешательства предпринимаются для контроля использования антибиотиков в клиниках и птицеводстве, подход к устранению существующих устойчивых к антибиотикам бактерий по-прежнему ограничен. Разработка новых классов антибиотиков, а также производных антибиотиков путем химических модификаций для получения производных антибиотиков являются основными стратегиями фармацевтических компаний и здравоохранения.

системы для устранения резистентности. Однако этот подход сложен, учитывая тот факт, что поиск промышленностью новых химических агентов, действующих на новые биологические цели, оказался непродуктивным. Другой важной стратегией является неантибиотический подход, включающий антибактериальные вакцины, фаговую терапию, иммуностимуляторы, адъюванты, противовирулентную терапию, пробиотики и их комбинации. К сожалению, разработка неантибиотических подходов отстала от ожиданий и достигла ограниченного успеха. Основной проблемой уничтожения устойчивых к антибиотикам бактерий является ограниченная концентрация антибиотиков, которая может быть достигнута внутри бактериальных клеток, что, вероятно, связано с повышенным оттоком или сниженным притоком антибиотиков. Таким образом, требуются новые подходы для преодоления этого ограничения, чтобы увеличить внутриклеточную концентрацию антибиотиков до определенного порога, чтобы можно было уничтожить устойчивые бактерии. Однако несколько линий доказательств продемонстрировали, что микробная среда затрудняет эффективность антибиотиков через метаболические процессы. Метаболиты, такие как индол, вырабатываемые субпопуляцией бактерий, но общие для всех, позволили всей популяции защититься от антибиотикового стресса. Газ — это еще один тип цитопротекторного агента, который защищает бактерии от широкого спектра антибиотиков, например, оксид азота смягчает вызванные антибиотиками ROS в бактериях, тем самым предотвращая гибель клеток. Таким образом, микросреда сообщества бактерий определяет восприимчивость к антибиотикам, что обеспечивает основу для разработки бактериальных метаболических путей для борьбы с устойчивостью к антибиотикам. Было доказано, что метаболиты являются полезным способом. Обработка персистеров, высокоустойчивой к антибиотикам субпопуляции бактерий, глюкозой, маннитом или фруктозой значительно усилит уничтожение персистеров аминогликозидами. Более того, несколько недавних исследований подчеркивают важность цикла TCA в борьбе с бактериями с множественной лекарственной устойчивостью. Продвижение трикарбонового цикла (цикла TCA) через экзогенный аланин, глюкозу и фруктозу может значительно повысить эффективность уничтожения канамицином различных типов бактерий с множественной лекарственной устойчивостью, таких как  Vibrio parahaemolyticus ,  Klebsiella pneumoniae ,  Pseudomonas aeruginosa  и  Staphylococcus aureus , персистеров и  in vivo  инфекций биопленки. Основной механизм включает метаболиты в продвижении цикла TCA, увеличивая генерацию NADH, субстратов для производства протондвижущей силы (PMF). Увеличение PMF в конечном итоге увеличило внутриклеточную концентрацию канамицина за счет усиления поглощения антибиотиков. Таким образом, эти исследования подчеркнули роль активации цикла TCA в уничтожении бактерий, устойчивых к антибиотикам, аминогликозидами. Более позднее исследование далее продемонстрировало, что настройка цикла TCA может влиять на восприимчивость к антибиотикам Pseudomonas aeroginosa  к антибиотикам. Таким образом, комбинаторное использование метаболита и антибиотиков имеет многообещающий потенциал в устранении бактерий, устойчивых к антибиотикам, путем «повторного использования» старых антибиотиков. Метаболический механизм аланина, глюкозы и фруктозы в потенцировании канамицина для уничтожения бактерий, устойчивых к антибиотикам, хорошо изучен в наших предыдущих исследованиях. Однако до сих пор не изучено, были ли задействованы другие механизмы в гибели клеток, вызванной аланином и антибиотиками. В этом исследовании мы приняли протеомный подход для изучения глобального изменения протеома в ответ на экзогенный аланин. Мы обнаружили, что экзогенный аланин влияет на экспрессию трех внешних мембранных белков. Кроме того, интегрированный анализ данных протеомики и метаболомики направляет наше внимание на ROS, которые могут быть синергически получены при сочетании аланина и канамицина. Таким образом, это исследование получает новое понимание механизмов уничтожения канамицином бактерий, устойчивых к антибиотикам, с помощью аланина. В нашем предыдущем отчете мы обнаружили, что экзогенный аланин перепрограммировал метаболом  Edwardsiella tarda  EIB202, представленный двенадцатью измененными метаболическими путями. Хотя метаболомные данные предоставили глубокое понимание того, как аланин модулирует метаболом целевой клетки и вызывает гибель бактерий с множественной лекарственной устойчивостью под действием канамицина, другие биологические процессы, которые участвуют, могут быть проигнорированы во время метаболомного анализа. Таким образом, мы реализовали протеомный подход для дальнейшего изучения изменения протеома, связанного с экзогенным аланином. Мы продолжили использовать  штамм E. tarda дикого типа  EIB202 с множественной лекарственной устойчивостью и обработали EIB202 дозой аланина (40 мМ), которую мы приняли ранее. После обработки целые клетки были лизированы, а общие белки были очищены, помечены с помощью iTRAQ и проанализированы с помощью LC-MS/MS. Всего было идентифицировано 1972 белка, из которых 40 белков были дифференцированно экспрессированы по сравнению с контрольной группой, обработанной солевым буфером (кратность среднего изменения более 1,5 и  p  < 0,05 в обоих биологических повторах считаются дифференцированно экспрессированными белками). Среди дифференцированных белков уровни экспрессии 22 белков были повышены, а 19 белков были снижены.

Metabolite-enabled killing of antibiotic-resistant pathogens by antibiotics is an attractive strategy to manage antibiotic resistance. Our previous study demonstrated that alanine or/and glucose increased the killing efficacy of kanamycin on antibiotic-resistant bacteria, whose action is through up-regulating TCA cycle, increasing proton motive force and enhancing antibiotic uptake. Despite the fact that alanine altered several metabolic pathways, other mechanisms could be potentially involved in alanine-mediated kanamycin killing of bacteria which remain to be explored. In the present study, we adopted proteomic approach to analyze the proteome changes induced by exogenous alanine. Our results revealed that the expression of three outer membrane proteins was altered and the deletion of nagE and fadL decreased the intracellular kanamycin concentration, implying their possible roles in mediating kanamycin transport. More importantly, the integrated analysis of proteomic and metabolomic data pointed out that alanine metabolism could connect to riboflavin metabolism that provides the source for reactive oxygen species (ROS) production. Functional studies confirmed that alanine treatment together with kanamycin could promote ROS production that in turn potentiates the killing of antibiotic-resistant bacteria. Further investigation showed that alanine repressed the transcription of antioxidant-encoding genes, and alanine metabolism to riboflavin metabolism connected with riboflavin metabolism through TCA cycle, glucogenesis pathway and pentose phosphate pathway. Our results suggest a novel mechanism by which alanine facilitates kanamycin killing of antibiotic-resistant bacteria via promoting ROS production. The widespread of antibiotic-resistant bacteria is a growing problem, imposing catastrophic threat to people in every country throughout the world. The control of antibiotic-resistant bacteria becomes an urgent issue to the society. Although governmental interventions are undertaken to control the use of antibiotics in clinics and poultry industry, the approach to eliminate the existing antibiotic-resistant  bacteria is still limited. Developing novel classes of antibiotics as well as antibiotic derivatives through chemical modifications to provide antibiotic derivatives are the main strategies by pharmaceutical companies and health care

systems to eliminate resistance. However, the approach is difficult given the fact that the industry’s search of novel chemical agents acting on new biological targets is proven to be non-productive. Another major strategy is the non-antibiotic approach including antibacterial vaccines, phage therapy, immunostimulants, adjuvants, anti-virulence therapies, probiotics and their combinations. Unfortunately, the development of non-antibiotic approaches lagged behind the expectation, and meet limited success. The major challenge to kill antibiotic-resistant bacteria is the limited concentration of antibiotics that can be achieved inside bacterial cells, which is likely due to the elevated efflux or reduced influx of the antibiotics. Novel approaches thus are required to overcome this limitation to increase the intracellular antibiotic concentration to a certain threshold so that the resistant bugs can be killed. However, several lines of evidences demonstrated that microbial environment confounds antibiotic efficacy through metabolic processes. Metabolites like indole, produced by a subpopulation of bacteria but shared by all enabled the whole population to defend against antibiotic stress. Gas is another type of cytoprotective agent that protects bacteria against a wide range of antibiotics, e.g., nitric oxide alleviates antibiotic-induced ROS in bacteria thus prevent cell death. The micro-environment of bacteria community is thus determining antibiotic susceptibility, which provides the basis to engineer bacterial metabolic pathways to combat antibiotic resistance. Metabolites have been proved to be a useful way. The treatment of persisters, the highly antibiotic-tolerant subpopulation of the bacteria, with glucose, mannitol or fructose would greatly enhance the killing of persisters by aminoglycosides. Moreover, several recent studies highlight the importance of TCA cycle in fighting against multidrug resistant bacteria. The promotion of tricarboxylic cycle (TCA cycle) through exogenous alanine, glucose and fructose could greatly enhance the killing efficacy of kanamycin on different types of multidrug-resistant bacteria like Vibrio parahaemolyticus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus, persisters, and in vivo biofilm infections. The underlying mechanism involves the metabolites in promoting TCA cycle, increasing the generation of NADH, the substrates for proton motive force (PMF) production. The increased PMF ultimately increased intracellular concentration of kanamycin through enhanced antibiotic uptake. Thus, these studies highlighted the role of activation of TCA cycle in killing antibiotic-resistant bacteria by aminoglycosides A later study further demonstrated that the tuning of TCA cycle could influence the antibiotic susceptibility of Pseudomonas aeroginosa  к антибиотикам. Таким образом, комбинаторное использование метаболита и антибиотиков имеет многообещающий потенциал в устранении бактерий, устойчивых к антибиотикам, путем «повторного использования» старых антибиотиков. Метаболический механизм аланина, глюкозы и фруктозы в потенцировании канамицина для уничтожения бактерий, устойчивых к антибиотикам, хорошо изучен в наших предыдущих исследованиях. Однако до сих пор не изучено, были ли задействованы другие механизмы в гибели клеток, вызванной аланином и антибиотиками. В этом исследовании мы приняли протеомный подход для изучения глобального изменения протеома в ответ на экзогенный аланин. Мы обнаружили, что экзогенный аланин влияет на экспрессию трех внешних мембранных белков. Кроме того, интегрированный анализ данных протеомики и метаболомики направляет наше внимание на ROS, которые могут быть синергически получены при сочетании аланина и канамицина. Таким образом, это исследование получает новое понимание механизмов уничтожения канамицином бактерий, устойчивых к антибиотикам, с помощью аланина. В нашем предыдущем отчете мы обнаружили, что экзогенный аланин перепрограммировал метаболом  Edwardsiella tarda  EIB202, представленный двенадцатью измененными метаболическими путями. Хотя метаболомные данные предоставили глубокое понимание того, как аланин модулирует метаболом целевой клетки и вызывает гибель бактерий с множественной лекарственной устойчивостью под действием канамицина, другие биологические процессы, которые участвуют, могут быть проигнорированы во время метаболомного анализа. Таким образом, мы реализовали протеомный подход для дальнейшего изучения изменения протеома, связанного с экзогенным аланином. Мы продолжили использовать  штамм E. tarda дикого типа  EIB202 с множественной лекарственной устойчивостью и обработали EIB202 дозой аланина (40 мМ), которую мы приняли ранее. После обработки целые клетки были лизированы, а общие белки были очищены, помечены с помощью iTRAQ и проанализированы с помощью LC-MS/MS. Всего было идентифицировано 1972 белка, из которых 40 белков были дифференцированно экспрессированы по сравнению с контрольной группой, обработанной солевым буфером (кратность среднего изменения более 1,5 и  p  < 0,05 в обоих биологических повторах считаются дифференцированно экспрессированными белками). Среди дифференцированных белков уровни экспрессии 22 белков были повышены, а 19 белков были снижены.