Журнал клинической и экспериментальной офтальмологии
Открытый доступ

Абстрактный

Усиленный хроматографический сигнал и УФ-спектроскопия поглощения для оценки лизоцима после термической денатурации и в экстрактах контактных линз

Клод Жиассон, Даниэль Белан и Ланжи Мишо

Цель: Усиление сигнала поглощения, связанного с лизоцимом, извлеченным из контактных линз, измеренного с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ); изучение чистоты лизоцима и того, насколько термическая денатурация влияет на его профиль элюирования.
Методы: В пробных хроматографических запусках, во время которых экстракты контактных линз вводились в систему, фракции, собранные между 4 и 5,5 минутами, указывали на лизоцим как на элюирующий белок, как показал вестерн-блот. Белки были извлечены из контактных линз в 50:50 растворе 0,2% трифторуксусной кислоты (ТФУ): ацетонитрила (ACN). Каждый экстракт контактных линз был разделен на 2 аликвоты. После вакуумного испарения аликвоты № 1 были растворены в исходной подвижной фазе для получения коэффициента обогащения 8. Аликвоты № 2 были оставлены необработанными в обычном растворе для экстракции. Калибровка сигнала поглощения при 220 нм позволила измерить уровни лизоцима на хроматограммах. Параллельные инъекции обеих аликвот в ВЭЖХ позволили сравнить их содержание лизоцима. Чистота извлеченного лизоцима оценивалась путем просмотра его спектра поглощения по пикам. Растворы лизоцима, предварительно нагретые до 80 и 100 °C, вводились и сравнивались с контрольными растворами. Различия в медианном содержании лизоцима между аликвотами № 1 и 2 и в площади пика лизоцима, нагретого по сравнению с контролем, были проверены непараметрическими методами.
Результаты: медианный уровень лизоцима, измеренный в обогащенных и обычных экстрактах, значительно различался (39,8 и 21,5 мкг соответственно). Однако после корректировки на различный объем инъекции и фактор концентрирования средний уровень обогащенного лизоцима (21,4 мкг) был близок к уровню, обнаруженному в обычном экстракте. Наблюдение за спектральным поглощением предполагает, что элюирующий лизоцим свободен от загрязняющих веществ. Медианные соотношения площадей пиков нагретого лизоцима к площади пиков контрольного лизоцима значительно отличались от 1 при температуре 100 °C (0,91), но не при 80 °C (0,95) с тестом знакового ранга. Даже при нагревании до 80 °C профиль элюирования лизоцима казался менее симметричным по сравнению с контролем и представлял дополнительную точку перегиба. Эти тонкие изменения усиливались при 100 °C.
Вывод: Обогащение лизоцима, извлеченного из контактных линз и солюбилизированного в исходной подвижной фазе, повышает чувствительность этой хроматографической процедуры. Этот хроматографический протокол в сочетании с УФ-спектроскопией поглощения может обнаруживать термическую денатурацию при 80 и 100 °C.