Журнал прикладной фармации
Открытый доступ
ISSN: 1920-4159
ISSN: 1920-4159
Чжанмин Се, Шаббир Ахмед, Вэньхуэй Лю, Сиси Конг, Инчунь Сюй, Тин Лю и Шуцин Чен
Человеческий цитохром P450 3A4 (CYP3A4) является наиболее распространенным ферментом I фазы метаболизма лекарств в печени, и примерно 50% лекарств на рынке метаболизируются CYP3A4. Поэтому многие исследования in vitro опирались на рекомбинантный CYP3A4 как на инструмент скрининга для оценки потенциальных взаимодействий лекарств (DDI) in vivo. Однако имеется ограниченная информация о рекомбинантном CYP3A4 с высокой каталитической активностью. Поэтому настоящее исследование было направлено на получение рекомбинантного CYP3A4 с высокой каталитической активностью и на характеристику его функций in vitro. Для усиления каталитической активности гетерологически экспрессируемого CYP3A4 фермент был слит с цитохромом b5 (b5) хвост к голове, и слитый фермент был вставлен вместе с НАДФН–P450 редуктазой (POR) в одну плазмиду для достижения одновременной экспрессии в клетках sf9. Здесь были исследованы сродство связывания субстрата, ферментативная активность и применение в in vitro DDI слитого фермента. Константа диссоциации Kd POR-cyt b5CYP3A4 составила 8,3 ± 0,87 мкмоль/л, Clint (Clint=Vmax/Km) составила 8,57 мл/мин/г белка для POR-cyt b5CYP3A4 в метаболизме тестостерона и 150,3 мл/мин/г белка для мидазолама. Кроме того, константа ингибирования Ki кетоконазола в метаболизме тестостерона составила 0,013 ± 0,0038 мкмоль/л. Представленные результаты свидетельствуют о значительном увеличении сродства связывания субстрата и ферментативной активности для слитого фермента. Таким образом, конструкция может быть полезна для изучения метаболизма лекарственных средств и исследования DDI, связанных с CYP3A4 in vitro. Кроме того, одновременная экспрессия слитого фермента и POR может обеспечить более воспроизводимые результаты на основе более стабильного молярного соотношения CYP3A4/POR/b5.