Журнал медицинских методов диагностики
Открытый доступ

Абстрактный

Оценка клинических лабораторных методов анализа бесклеточной ДНК плазмы при подозрении на сепсис

Урошевич Н., Инглис Т.Дж.Дж., Граско Дж. и Лим Э.М.

Предыстория: Количество и качество свободной от плазматических клеток ДНК (cfDNA) изменяется в экстремальных физиологических и патологических состояниях. Эти изменения могут стать основой для нового прогностического биомаркера в таких разнообразных состояниях, как беременность, рак, трансплантация органов и сепсис. Оценка текущих методов анализа cfDNA необходима для определения наилучшего практического подхода к медицинской диагностике.

Методы: Первоначально cf DNA была извлечена из плазмы девяти пациентов с лихорадочным заболеванием с использованием наборов QIAamp Circulating Nucleic Acid и QI Aamp Mini Blood DNA. Концентрация cfDNA была определена с помощью β-глобиновой qPCR с использованием смесей PerfeCta и AmpliTaq. Впоследствии для анализа cfDNA плазмы от 64 дополнительных пациентов с подозрением на септицемию и положительными культурами крови использовались флуориметрические и гель-на-чипе Qubit.

Результаты: Определение концентрации CfDNA с помощью количественной ПЦР гена β-глобина с использованием смеси AmpliTaq превосходило количественную ПЦР PerfeCta. Более того, в отличие от PerfeCta, количественная ПЦР AmpliTaq определяла схожие числа копий генома в cfDNA, выделенной любым из методов экстракции ДНК. Набор QIAamp Mini Blood и количественная ПЦР AmpliTaq впоследствии использовались в более крупном проспективном исследовании для выделения и количественной оценки cfDNA соответственно. Однако количественная ПЦР оказалась менее подходящей для обнаружения высоких уровней cfDNA в плазме по сравнению с прямым измерением ДНК с помощью Qubit (среднее значение 22,23 нг/мл против 61,38 нг/мл соответственно), несмотря на хорошую корреляцию между двумя методами. Затем для определения размеров фрагментов cfDNA и их относительных концентраций использовался метод микрофлюидного чипа ДНК, что выявило наличие фрагментов ДНК размером с нуклеосому, которые находились в сильной положительной корреляции с общей cfDNA. Кроме того, апоптотическая ДНК была идентифицирована как основной компонент ДНК в плазме с высоким содержанием cfDNA.

Выводы: β-глобин qPCR больше подходит для обнаружения низких концентраций cfDNA в плазме, в то время как анализ Qubit является лучшим выбором для быстрой идентификации высоких концентраций в плазме. Апоптоз является основным источником cfDNA в плазме с высокими концентрациями cfDNA на основе анализа ДНК-чипа.