Иммунотерапия: открытый доступ
Открытый доступ

Абстрактный

Мультиплексная иммуногистохимия: важность порядка окрашивания при создании валидированного протокола

Джихад Сайед, Джек Эштон, Джезукристофер Джозеф, Джемма Н. Джонс, Кристиан Слэйтер, Алан Шарп, Гарри Эштон, Уильям Ховат, Ричард Байерс, Хелен К. Энджелл

Цель: Сложность многофакторных заболеваний, таких как рак, создает значительные проблемы для разработки персонализированных методов лечения. Интегрированный цифровой гистологический анализ опухолей обеспечивает лучшее понимание иммунной микросреды и прогностической связи, связанной с подсчетом и распределением специфических субпопуляций инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL). Для этого мультиплексная маркировка клеток, наряду с мультиспектральной визуализацией (MSI), является подходом, который все чаще используется для достижения более точного фенотипирования и количественной оценки TIL in situ. Однако эти подходы требуют полной проверки перед использованием, что является основной целью данного исследования.

Методы: Целые срезы и микрочипы тканей, богатых лимфоцитами, использовались для разработки и проверки протокола мультиплексной иммунофлуоресценции (IF) для одновременного опроса MSI до шести интересующих антигенов иммунных клеток; CD3, CD8, FOXP3, CD20, PD-L1 и PD1. Впервые было достигнуто соответствие между одноплексной хромогенной иммуногистохимией (IHC) и одноплексным иммунофлуоресцентным (IF) окрашиванием. Впоследствии был исследован эффект положения в мультиплексном порядке IF для любого заданного антитела, понимая влияние стерических помех антитела и условий удаления антитела.

Результаты: В методах, где мультиплексирование обеспечивается с использованием извлечения антигена для удаления предыдущих антител, основным фактором, влияющим на валидацию мультиплексного анализа, является нелинейный и неоднородный эффект длительного времени извлечения эпитопа под действием тепла (HIER), поскольку антитела продвигаются по порядку в мультиплексном протоколе.

Заключение: Это исследование демонстрирует точность мультиплексного окрашивания как репрезентативного варианта одноплексного окрашивания, влияние порядка окрашивания антител и предлагает основу для создания оптимизированных мультиплексных иммунофлуоресцентных протоколов.