Журнал гликомики и липидомики
Открытый доступ

Абстрактный

Анализ N-гликанов на моноклональных антителах с использованием MALDI-Q-IT-TOF

Гульче Озмен

Моноклональные антитела (МАб) все чаще используются для лечения рака или других аутоиммунных заболеваний. Правильная структура гликанов МАб имеет важное значение для функциональной и биологической активности соответствующих МАБ, такой как идентификация антигенов, запускаемых клетками иммунной системы, регуляция сигнальной активности и физико-химических свойств производимых терапевтических средств и т. д. Поэтому быстрый мониторинг структуры гликанов имеет решающее значение для производства терапевтических препаратов, производства биоподобных препаратов и процессов контроля их качества.

Принципиальной частью данного исследования является характеристика гликановой структуры MAbs. В нашем исследовании была охарактеризована гликановая структура трастузумаба, используемого в качестве препарата для лечения рака молочной железы. N-гликаны были ферментативно высвобождены из белковой структуры трастузумаба путем переваривания трипсином и расщепления PNGase F (пептид:N-гликозидаза F). Кроме того, для целей очистки перед обнаружением MALDI-TOF-MS (матричная лазерная десорбция/ионизация-времяпролетная масс-спектрометрия) использовались специальные процедуры замены буфера и твердофазной экстракции.

После разработки соответствующей обработки образцов и оптимизации гликаны GO, GOF, G1, G1F, GOF-GN были четко обнаружены с помощью MALDI-Q-IT-TOF MS без какой-либо маркировки или использования каких-либо дополнительных методов хроматографического разделения.

Текущий доклад посвящен теоретическим и экспериментальным аспектам MALDI-Q-IT-TOF MS для изучения гликанов на моноклональных антителах. Будут рассмотрены процедуры подготовки образцов и советы по измерениям MALDI-TOF-MS, а также будут представлены исходные данные, полученные с помощью MALDI-Q-IT-TOF MS.

 Гликозилирование является критически важным атрибутом для разработки и производства терапевтических моноклональных антител (mAbs) в фармацевтической промышленности. Обычный анализ гликанов антител обычно выполняется методом гидрофильной жидкостной хроматографии взаимодействия (HILIC) с 2-аминобензамидом (2-AB) после высвобождения гликанов. Хотя этот метод дает удовлетворительные результаты, он имеет ограниченное применение для скрининга большого количества образцов, поскольку требует дорогостоящих реагентов и занимает несколько часов или даже дней для подготовки образца. Простого и быстрого метода анализа гликанов не было. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы

разработали и сравнили 2 сверхбыстрых метода анализа антител на гликан (UMAG), которые включают быстрое получение и очистку гликопептидов либо в органическом растворителе, либо в водном буфере с последующей количественной оценкой без метки с использованием матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации-времяпролетной масс-спектрометрии. Оба метода быстро дают профили N-гликанов тестовых антител, аналогичные полученным методом 2-AB HILIC-HPLC. Кроме того, метод UMAG, выполняемый в водном буфере, имеет более короткое время анализа менее 15 мин и обеспечивает высокопроизводительный анализ в 96-луночных планшетах ПЦР с минимальной обработкой образцов. Этот метод, самый быстрый и простой из известных на сегодняшний день, был оценен для гликопрофилирования mAb, экспрессируемых в различных условиях культивирования клеток, а также для оценки клонов культур антител и различных партий продукции. Важно, что метод чувствительно улавливал изменения в гликопрофилях, обнаруженных традиционными методами 2-AB HILIC-HPLC или HILIC-UPLC. Простота, высокая скорость и низкая стоимость этого метода могут облегчить проведение фундаментальных исследований и разработку процессов для новых моноклональных антител и биоаналогичных продуктов.

(MALDI) источник, квадрупольная ионная ловушка (QIT) и рефлектрон времяпролетный (reToF) масс-спектрометр (MS) были разработаны. Компьютерное моделирование было проведено для моделирования различных методов эффективного введения ионов MALDI в QIT и последующего извлечения ионов из QIT в двухступенчатый бессеточный reToF. Параметры системы были оптимизированы для получения почти 100% эффективности улавливания и наивысшего разрешения по массе. Был построен прототип прибора для реализации производительности, предсказанной на основе компьютерного моделирования. Были разработаны методы почти ортогонального лазерного облучения образца, быстрого переключения высокоамплитудных радиочастотных (РЧ) напряжений и двухступенчатый бессеточный рефлектрон. Эти новые разработки были объединены с рядом других уже известных методов для обеспечения возможности выполнения высокоэффективного улавливания ионов и анализа MS/MS и выше (MS ⁿ ). Были получены высокие массовые спектры для m/z до 16 000, и  были успешно проведены эксперименты MS ³ . Достигнута чувствительность 0,1 фмоль при разрешении по массе более 3000.

Терапевтические моноклональные антитела (mAbs) представляют собой гликопротеины, вырабатываемые живыми клеточными системами. Гликановые фрагменты, присоединенные к белкам, могут напрямую влиять на стабильность белка, биоактивность и иммуногенность. Поэтому гликановые варианты гликопротеинового продукта должны быть адекватно проанализированы и проконтролированы для обеспечения качества продукта. Однако присущая сложность гликозилирования белка представляет собой сложную аналитическую задачу. В этом обзоре представлена ​​обновленная информация о последних достижениях в анализе гликанов, включая потенциальную полезность микрочипов на основе лектина для высокопроизводительного профилирования гликанов. Особое внимание уделяется сравнению основных типов аналитики для использования при определении уникальных характеристик гликанов, таких как сайт гликозилирования, структура и содержание гликана.

Биография

Она получила степень бакалавра наук в области биохимии на факультете естественных наук в Университете Эге в 2006 году. В настоящее время она пишет магистерскую диссертацию на тему «Анализ гликанов моноклональных антител» и получит диплом летом 2017 года. В то же время она работает научным сотрудником в Центре исследований и разработок лекарственных средств и фармакокинетических приложений (ARGEFAR) с 2008 года. Ее профессиональный опыт включает использование методов ВЭЖХ, ЖХ-МС, МАЛДИ-ТОФ-МС. Ее исследовательские интересы охватывают физико-химическую характеристику биоаналогичных препаратов и биофармацевтику.