Журнал гликомики и липидомики
Открытый доступ

Абстрактный

Количественная оценка липидов: модель, реальность и компромисс

Spiro Khourey

Липиды являются ключевыми молекулами в различных биологических процессах, поэтому их количественное определение является решающим моментом во многих исследованиях и должно учитываться при разработке липидомики. Это семейство является сложным и представляет собой очень большое разнообразие структур, поэтому анализ и количественное определение всего этого разнообразия является настоящей проблемой. В этом обзоре будут представлены различные методы анализа липидов: от ядерного магнитного резонанса (ЯМР) до масс-спектрометрии (с хроматографией и без нее), включая универсальные детекторы. Прежде всего, будет представлено современное состояние количественного определения с определениями терминов и стандартизацией протоколов с учетом количественной липидомики, а затем будут обсуждены технические соображения и ограничения инструментов аналитической химии, таких как ЯМР, масс-спектрометрия и универсальные детекторы, особенно с точки зрения абсолютного количественного определения.  Липиды представляют собой большой и сложный класс гидрофобных и амфипатических малых молекул с огромным структурным разнообразием (например, различные комбинации жирных ацилов и функциональных головных групп в фосфолипидах). Их можно разделить на восемь основных групп в соответствии с консорциумом Lipid Maps: жирные ацилы, глицеролипиды, глицерофосфолипиды, сфинголипиды, стероловые липиды, преноллипиды, сахаролипиды и поликетиды. Изменения уровня и/или состава видов и/или классов липидов происходят после возмущения или в ходе нескольких физиологических процессов. Поэтому важно иметь возможность профилировать липидом с серьезной аннотацией и определять абсолютное или относительное содержание одного, нескольких или всех липидов, присутствующих в интересующем образце. Однако химическая гетерогенность липидов, наличие многих изомерных и изобарных видов и большой диапазон концентраций, в котором обнаруживаются липиды, исключают измерение полных профилей липидома с помощью одного аналитического метода и значительно затрудняют количественную оценку этого семейства. Каждый класс (семейство) липидов,   особенно сложные липиды, такие как сфинголипиды или глицерофосфолипиды, представляют большое количество молекулярных видов, что усложняет их абсолютную количественную оценку. К счастью, некоторые процессы доступны для количественной оценки этих молекул, но с некоторыми ограничениями. Целью этого обзора является рассмотрение различных предлагаемых методов: универсальных детекторов, таких как Corona-CAD (детектор заряженных аэрозолей) и ELSD (детектор испарительного рассеяния света), ЯМР (ядерный магнитный резонанс) и МС (масс-спектрометрия) с хроматографическим разделением или без него, а также обсуждение их преимуществ и ограничений для количественной оценки липидов .Количественный анализ липидов быстро расширялся в течение последних двух десятилетий одновременно с достижениями в таких технологиях, как МС и ЯМР, и число опубликованных методов, связанных с этим, все еще растет. Однако следует соблюдать некоторые меры предосторожности в процессе биоанализа, чтобы получить точный результат, особенно когда речь идет об абсолютной количественной оценке, т. е. назначении количества или концентрации из аналитического отклика. Независимо от цели исследования (омика, токсикологическая, фармацевтическая и т. д.), количественные биоаналитические методы имеют решающее значение для интерпретации результатов, что подчеркивает необходимость иметь универсальные процедуры валидации. Таким образом, в 1990 и 2000 годах регулирующими органами и научными сообществами было проведено два семинара для гармонизации процедур валидации и определения основных параметров валидации с их критериями приемлемости. В результате этих семинаров было разработано несколько руководств, в которых подробно описаны методологии и критерии приемлемости для каждого параметра валидации. Действительно, они предлагают использовать эталонные стандарты, добавленные в ту же матрицу предполагаемых исследований, чтобы установить калибровочную кривую и образцы контроля качества. Эти калибраторы и контроль качества должны быть извлечены с тем же протоколом, что и исследуемые образцы, и с использованием внутреннего стандарта, который должен быть наиболее близок к аналитам. Этот последний пункт важен, особенно когда речь идет об абсолютной количественной оценке. Для липидов мы можем выделить два случая: простые липиды, такие как стерины и жирные кислоты с их производными, и сложные липиды, такие как сфинголипиды, глицеролипиды или глицерофосфолипиды. В первом случае доступны чистые аналитические стандарты для подготовки калибровочных кривых. Во втором случае для сложных липидов в биологическом образце могут быть обнаружены сотни молекулярных видов для каждого семейства. Сегодня на сайте Lipid Maps перечислено 9856 видов глицерофосфолипидов, и только около 80 аналитических стандартов доступны в продаже. То же самое относится и к сфинголипидам: на сайте Lipid Maps можно найти 4411 видов, и очень мало видов доступно. При таких обстоятельствах мы не сможем получить калибровочные кривые для каждого молекулярного вида, и поскольку мы знаем, что обнаружение чувствительно к природе молекулы (особенно в случае жирных кислот), абсолютная количественная оценка будет невозможна. Кроме того, перед проведением анализов следует провести полную процедуру валидации, включая оценку селективности, диапазона концентраций калибровочной кривой, точности, прецизионности, извлечения и чувствительности. Более того, рекомендуется регулярно проводить валидацию анализов, выполняя новую извлеченную калибровочную кривую и/или серию качественных контрольных образцов каждый день. Эти этапы валидации могут быть очень сложными, когда несколько аналитов с различными физико-химическими свойствами должны быть проанализированы в одном и том же цикле, включая утомительные этапы подготовки и экстракции образцов.Более того, эти руководящие принципы в основном адресованы фармацевтическим и токсикологическим приложениям, что подразумевает, что они в основном созданы для количественной оценки экзогенных соединений в биологических матрицах. В случае липидомных исследований, где интересующие соединения являются эндогенными, абсолютная количественная оценка может быть достигнута с помощью стандартного метода добавления, с использованием суррогатных матриц или с использованием изотопного разбавления, когда липиды обнаруживаются с помощью масс-спектрометрии. Однако аналитические стандарты липидов в большинстве случаев не являются коммерчески доступными, что означает, что может применяться только относительная количественная оценка, т. е. сравнение количества аналита с аналитом референса..