Журнал хроматографии и методов разделения
Открытый доступ

Абстрактный

Быстрое фракционирование пептидов в растворе с помощью изоэлектрической фокусировки для глубокого анализа протеома

Мастробуони Дж., Засада К., Биндель Ф., Эберхард Л. и Кемпа С.

Взаимодействие между разрешением, точностью, чувствительностью и скоростью масс-спектрометра, а также сложностью пептидной смеси по отношению к хроматографическому разделению и времени анализа в конечном итоге определяет количество идентифицированных белков в рамках протеомного исследования «shotgun». Улучшение одного из этих параметров может повысить качество протеомного анализа. Здесь мы оценили метод изоэлектрического фокусирования в растворе (IEF) для предварительного фракционирования триптических пептидов перед протеомным анализом на основе LC-MS/MS. IEF в растворе оказался простым и быстрым методом фракционирования пептидов перед анализом LC-MS. Адаптировав экспериментальные процедуры, этот подход позволил идентифицировать более 44 000 пептидов, принадлежащих 5800 белкам, менее чем за 48 рабочих часов, от экстракции белка до окончания анализа LC-MS. Этот метод был успешно применен для анализа протеомов клеток млекопитающих и различных модельных организмов без дополнительных усилий или специального технического оборудования. Растворимый ИЭФ пептидов очень надежен и может применяться в сочетании с различными процедурами экстракции. Большое количество идентифицированных пептидов с использованием стандартной системы ЖХ-МС привело к среднему покрытию белка 25%. Такое большое среднее количество идентифицированных пептидов на белок улучшило дискриминацию видов белка как изоформ или вариантов сплайсинга. Таким образом, растворимый ИЭФ является быстрой и надежной альтернативой гелевой протеомике или другим методам фракционирования без геля перед анализом ЖХ-МС/МС. Сокращение времени обработки и высокая производительность этого метода могут значительно ускорить глубокий протеомный анализ.