Журнал термодинамики и катализа
Открытый доступ

Абстрактный

Снижение гидрофобности интеркаляционной петли малой бороздки имеет решающее значение для эффективного катализа с помощью адаптированной к холоду урацил-ДНК N-гликозилазы из атлантической трески

Элин Мо, Нетсанет Гизав Ассефа, Ингар Лейрос, Катрин Торсет, Арне О Смалас и Нильс Педер Виллассен

Малая петля интеркаляции бороздки (лейциновая петля) в урацил-ДНК N-гликозилазах (UNG) претерпевает значительные конформационные изменения при взаимодействии с субстратом. Предыдущие исследования показали, что адаптированная к холоду атлантическая треска UNG (cUNG) обладает в десять раз более высокой каталитической эффективностью, чем человеческий UNG (hUNG). Выравнивание последовательностей двух ферментов выявило замены аминокислот в лейциновой петле cUNG и рядом с ней, что может увеличить эластичность петли и, таким образом, объяснить наблюдаемую более высокую каталитическую эффективность cUNG по сравнению с hUNG. Для того чтобы исследовать эту гипотезу, мы сконструировали пять одиночных и четыре множественных мутанта cUNG с заменами трески на человеческий UNG и охарактеризовали их с помощью кинетических экспериментов при трех различных температурах (15, 22 и 37 °C) и дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Результаты показали, что мутации повлияли на kcat больше, чем на KM, и мутанты с очевидными сниженными гидрофобными свойствами (A266T, V267A, A266T/V267A и A266T/V267A/A274V) показали повышенный или эквивалентный kcat по сравнению с cUNG, в то время как мутанты с прогнозируемой повышенной гидрофобностью (A274V, H275Y, L279F, A266T/V267A/A274V/H275Y и A266T/V267A/A274V/H275Y/H250Q) показали сниженный kcat по сравнению с cUNG. Таким образом, имитация аминокислотного состава лейциновой петли в hUNG снижает активность cUNG. Эксперименты DSC были проведены с целью выявления потенциального увеличения общей стабильности мутантов в результате измененной гидрофобности лейциновой петли. Однако результаты показали небольшое снижение общей стабильности для мутантов с увеличенным kcat и повышенную стабильность для мутантов с уменьшенным kcat. Мы предполагаем, что эти результаты возникают из-за необходимости компенсировать потенциально увеличенную/уменьшенную эластичность лейциновой петли, которая вводится заменами аминокислот. Это исследование подтверждает предполагаемую важность лейциновой петли для эффективного катализа UNG и показывает, что можно изменить каталитическую способность этого фермента, манипулируя аминокислотным составом этой петли.