Журнал медицинских методов диагностики
Открытый доступ

Абстрактный

Повторная оценка анализа структуры хроматина сперматозоидов (SCSA)

Сатору Канеко, Киёси Такамацу

Анализ структуры хроматина сперматозоидов (SCSA), основанный на полихроматической флуоресценции акридинового оранжевого (AO), широко применяется для наблюдения за повреждениями ДНК в ядрах сперматозоидов человека. Для переоценки принципа SCSA подвижные сперматозоиды человека с отрицательной скоростью фрагментации ДНК 87% были подготовлены в качестве отрицательного контроля (NC), а положительный контроль (PC) был подготовлен путем тепловой денатурации NC. Окрашиваемость AO для контролей сравнивалась на основе микроскопических, электрофоретических и проточно-цитометрических наблюдений. Подвижные сперматозоиды человека были разделены с помощью центрифугирования в градиенте плотности Перколла и последующего всплытия. Затем фрагментацию ДНК наблюдали с помощью электрофореза в геле с импульсным полем в одиночных ячейках.

Мы обнаружили, что молекула АО испускала красную и зеленую флуоресценцию в зависимости от длины волны возбуждения. Оба контроля меняли цвет с зеленого на красный по мере увеличения концентрации АО и не имели красной флуоресценции после внутригельного переваривания трипсином. Изменение цвета NC с красного на зеленый и фрагментация ДНК происходили одновременно во время фотообесцвечивания. Цитограммы NC и PC были похожи друг на друга. Эти факты противоречат принципу SCSA. Зеленая и красная флуоресценция испускались из-за интеркаляции AO в ДНК и адсорбции AO на белках соответственно, и их слияние приводило к изменению цвета. Изменение цвета с красного на зеленый во время фотообесцвечивания, возможно, наблюдалось потому, что зеленая флуоресценция от интеркалированного AO была более устойчива к активным формам кислорода, чем красная флуоресценция от адсорбции AO на некоторых белках. В целом, SCSA не может обнаружить повреждение ДНК в ядре сперматозоида человека.