Журнал клинической и экспериментальной офтальмологии
Открытый доступ

Абстрактный

Поиск альтернативно сплайсированных вариантов фосфолипазного домена, содержащего 2 (Pnpla2), нового гена в сетчатке

Жаклин Талеа Дежарден, С. Патрисия Бесерра и Прити Субраманиан

Цель: Ensembl и другие базы данных экспрессируемых последовательностей (EST) выявляют предполагаемые альтернативные варианты сплайсинга у мышей и крыс для Pnpla2 , гена, кодирующего рецептор фактора, полученного из пигментного эпителия (PEDF-R). Целью данного исследования было получение экспериментальных доказательств вариантов сплайсинга Pnpla2 у мышей.

Материалы и методы: Использовались культуры мышиной клеточной линии, полученные из фоторецепторов (клетки 661W) и тканей глаза, сердца, жировой ткани, почек и печени мыши. Из клеток и тканей выделяли информационную РНК (мРНК) и синтезировали комплементарную ДНК (кДНК). Пары праймеров полимеразной цепной реакции (ПЦР) были разработаны для фланкирования предполагаемых участков сплайсинга. Для снижения амплификации полноразмерного транскрипта Pnpla2 и усиления амплификации малораспространенных вариантов сплайсинга использовалась ПЦР с исключением экзонов в реальном времени. Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле и обнаруживали с помощью УФ-трансиллюминатора. Рекомбинантные плазмиды, содержащие полноразмерную человеческую кДНК PNPLA2 или кДНК PNPLA2, лишенную экзона 5b (E5b), служили контролями для проверки методик. Были приготовлены полные клеточные лизаты из клеток 661W. Обнаружение белка PEDF-R проводили с помощью вестерн-блоттинга.

Результаты: Продукты ПЦР для транскриптов Pnpla2 , полученных из клеток 661W или различных тканей мыши, разделились на одну полосу после амплификации с несколькими парами праймеров. Одновременная амплификация двух кДНК PNPLA2 в различных молярных соотношениях предотвратила обнаружение менее распространенных транскриптов. Однако даже когда кДНК для полноразмерного транскрипта Pnpla2 была значительно исключена с использованием метода исключения экзонов, полосы, соответствующие вариантам сплайсинга Pnpla2, не были обнаружены. Тем не менее, вестерн-блоты общих лизатов клеток 661W с двумя различными антителами выявили изоформы для белка PEDF-R.

Выводы: Полученные данные свидетельствуют о существовании единственного полноразмерного транскрипта Pnpla2 , который может привести к образованию единственного белкового продукта, подвергающегося посттрансляционной обработке.