Журнал клинических испытаний
Открытый доступ

Абстрактный

Чувствительное обнаружение рецептора эпидермального фактора роста T790M с использованием ПЦР в реальном времени BNAClamp

Остин Динкель, Рэйчел А. Хоффмайстер, Эндрю Хакелби, Аарон С. Кастро, Мигель М. Кастро, Сунгкун Ким*

Мутации рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) вызывают различные виды рака, включая рак груди и легких. Единичная мутация T790M в домене тирозинкиназы EGFR означает ответ на противораковый препарат гефитиниб, что приводит к развитию резистентности к такому препарату. Таким образом, обнаружение мутации обеспечивает эффективные терапевтические возможности для пациентов, нуждающихся в лечении противораковыми препаратами. Мы стремились разработать простой и быстрый метод обнаружения мутации T790M с использованием мостиковых нуклеиновых кислот (BNA), которые, как известно, усиливают гибридизационное сродство олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды, содержащие основания BNA, называемые BNA-clamp и предназначенные для блокирования реакции ПЦР против генов дикого типа, использовались для различения присутствия мутантных генов, смешанных с большим количеством генов дикого типа. ПЦР в реальном времени в сочетании с BNA-зажимом позволяет нам наблюдать различные степени амплификации ПЦР в зависимости от соотношения генов дикого типа и мутантных генов. В попытке изучить эту возможность было подготовлено несколько 13-мерных олигонуклеотидных зажимов с различным количеством оснований BNA. Анализ значения Tm предполагает, что зажимы, содержащие 9 оснований BNA (BNA-зажим-9), будут наиболее эффективными для различения мутантных генов от генов дикого типа, а тесты чувствительности с использованием BNA-зажима-9 показали, что зажим способен обнаруживать 0,1% или более низкие уровни мутации T790M среди генов дикого типа. Кроме того, структуры связывания были проанализированы с помощью моделирования молекулярной динамики (MD), что показало, что BNA-зажим-9 искажает первоначально сконструированную структуру BDNA. Кроме того, с помощью зонтичной выборки были получены свободные энергии связывания с -60 кДж/моль для гена дикого типа и -40 кДж/моль для мутантного гена. Эта технология фиксации BNA и ПЦР в реальном времени может стать перспективным направлением для обнаружения клинически важных мутаций в будущем.