Журнал медицинских методов диагностики
Открытый доступ

Абстрактный

Двухэтапный анализ исключения красителя для сперматозоидов для оценки целостности плазматических и органелльных мембран — новый подход к контролю качества спермы для интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов

Сатору Канеко, Юки Окада, Киёси Такамацу

Цель: Комплексная оценка плазматических и органелльных мембран является новым подходом к пониманию фертильности спермы человека. В настоящем исследовании были разработаны 2 типа специфичных для спермы двухэтапных анализов исключения красителя для оценки плазматических и органелльных мембран в сперме человека.

Методы: Двухэтапный анализ исключения красителя для сперматозоидов: сперматозоиды инкубировались с реактивным красным 195 (RR195) или конканавалином А, конъюгированным с Cy3 (Cy3-con A) в изотонической культуральной среде, их контрастно окрашивали реактивным синим 222 или конканавалином А, конъюгированным с Alexa 488, после исключения плазматической мембраны метанолом соответственно. Целостность мембраны органелл в митохондриях наблюдалась по удерживанию Mito Tracker FM. Клетка ROX Orange давала оранжевую флуоресценцию при окислении прореагировавшими активными формами кислорода.

Результаты: Двухэтапный анализ исключения красителя для сперматозоидов состоит из проникновения и связывания первого красителя с ядрами через поврежденные плазматические и органелльные мембраны, после исключения мембраны вновь открытые ядра или внутренняя акросомальная мембрана контрастно окрашиваются вторым красителем. Неповрежденные плазменные и акросомальные мембраны в подвижных сперматозоидах человека (живые сперматозоиды; LS) исключали RR195 и Cy3-con A, но денатурированные допускали проникновение. LS окрашивал в синий или зеленый цвет или производил зеленую флуоресценцию, с одной стороны, денатурированные производили красную или красную флуоресценцию, соответственно. Флуоресценция Mito Tracker FM и cellROX Orange в митохондриях подтверждает нормальность окислительного фосфорилирования в митохондриях с неповрежденной органелльной мембраной. Производный одноэтапный анализ исключения RR195 является жизнеспособным кандидатом для интраоперационной неразрушающей оценки подвижных сперматозоидов в клинической ИКСИ.

Заключение: Анализы исключения красителя и задержки красителя используются для предоперационной оценки качества спермы, а модифицированный одноэтапный анализ исключения красителя может быть полезен для интраоперационного отбора сперматозоидов при клинической интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов соответственно.