Передовые методы в биологии и медицине
Открытый доступ

Абстрактный

Стратегия определения состояния фосфорилирования β1-адренорецепторов in vivo

Кодзо Хаяси и Хироюки Кобаяши

β1-адренергический рецептор (Adrb1), член суперсемейства рецепторов, сопряженных с G-белком (GPCR), является критическим регулятором функции сердца. Все GPCR фосфорилируются в нескольких местах, и специфическая схема фосфорилирования действует как «штрихкод» для регулирования функции рецептора и последующих физиологических процессов тканеспецифическим образом. Однако о местоположении и функции участков фосфорилирования Adrb1 in vivo известно мало из-за отсутствия специфических антител. В качестве первого шага для определения состояний фосфорилирования Adrb1 и связанных с ними функций в сердце мыши in vivo мы разработали следующую экспериментальную стратегию: 1) идентификация зависимых от агониста участков фосфорилирования Adrb1 в изолированном перфузируемом сердце мыши с использованием передовых методов фосфопротеомики; 2) окончательное назначение этих участков фосфорилирования с помощью высококачественных данных масс-спектрометрии (МС), полученных из клеток HEK 293T, сверхэкспрессирующих Adrb1; 3) создание мышей knock-in (KI), экспрессирующих Adrb1, слитый с FLAG-tag на N-конце для иммуноаффинной очистки с целью выявления статуса фосфорилирования в живом организме; 4) выяснение уровней фосфорилирования в определенных участках Adrb1 в сердце мыши KI с помощью масс-спектрометрических измерений соотношений интенсивности ионов фосфорилированного пептида к соответствующему нефосфорилированному пептиду. Используя эту стратегию, мы идентифицировали Ser462 на C-конце Adrb1 как агонист-зависимый участок фосфорилирования в перфузируемом сердце мыши. Мы также выявили базальные соотношения фосфорилирования на Ser274 (0,25), Ser417 (0,55) и Ser462 (0,0023) у мышей KI. Эти результаты дают новое представление о регуляторных механизмах функции Adrb1, опосредованных сайт-специфическим фосфорилированием.