Достижения в области генной инженерии
Открытый доступ

Абстрактный

Два способа контроля экспрессии CjCas9 при делеции патогенного повтора GAA в гене фратаксина

Пуире Ямеого

 Большинство случаев атаксии Фридриха вызваны вставкой последовательности повтора GAA (GAAr) в первый интрон гена фратаксина, что приводит к снижению экспрессии белка. Удаление этого GAAr с помощью технологии CRISPR-Cas9 приводит к увеличению экспрессии фратаксина. Из-за ограниченного размера упаковки AAV для удаления GAAr с помощью SpCas9 потребовалось два аденоассоциированных вируса (AAV). Использование 2 AAV снижает эффективность потенциального лечения, поскольку каждая клетка должна быть инфицирована обоими вирусами. Поэтому мы использовали CjCas9, поскольку он достаточно мал, чтобы доставляться с двумя sgRNA одним AAV. Однако конститутивная экспрессия гена CjCas9, доставляемая AAV in vivo, может увеличить нецелевые мутации и вызвать иммунный ответ против белка Cas9. Временная экспрессия важна для системы CRISPR. Мы исследовали два подхода к ограничению экспрессии нуклеазы.

Во-первых, молекулярный Hara Kiri, мы одновременно трансфицировали в клетки HeLa плазмиды, кодирующие CjCas9, два гида (до и после GAAr), нацеленные на ген фратаксина, и два гида, нацеленные на ген CjCas9. Наши результаты показали, что, несмотря на самоуничтожение гена CjCas9, эффективное редактирование генома гена FXN было получено in vitro.

Во-вторых, CRISPR-SCReT (Stop Codon Read Through), мы вставили стоп-кодон (TGA) в начало гена CjCas9, чтобы подавить его экспрессию. Затем мы индуцировали экспрессию Cas9 молекулами, способными обеспечить трансляцию, несмотря на наличие преждевременного стоп-кодона. Эта плазмида была трансфицирована в клетки 293T с двумя sgRNA (pre и post GAAr). Мы отметили делецию GAAr только в клетках, обработанных G418.

Эти различные методы позволили получить эффективное редактирование гена фратаксина, предотвращая при этом устойчивую экспрессию Cas9. Это может снизить вероятность нецелевых мутаций и иммунной реакции против белка Cas9.