Журнал пробиотиков и здоровья
Открытый доступ

Абстрактный

Целостность клеточной стенки и формирование протопласта пробиотика Lactobacillus acidophilus с помощью флуоресцентного окрашивания и флуоресцентной микроскопии

Райан Пейдж, Дэвид Бурк, Каянуш Ариана

Для идентификации протопласта бактериальных клеток ранее применялась фазово-контрастная микроскопия. Этот метод определяет протопласт по их размеру и изменению формы. Более проверяемый метод может быть использован с использованием флуоресцентных красителей, которые нацелены на определенные клеточные компоненты. Целью данного исследования было использование методов флуоресцентной микроскопии для определения наличия или отсутствия бактериальных клеточных стенок в пробиотике Lactobacillus acidophilus после воздействия пищеварительных ферментов клеточной стенки. Бактериальные клетки обрабатывали различными концентрациями лизоцима [0, 175, 250, 425 мкг/мл] и инкубировали при температуре 37°C в течение десяти минут. После обработки лизоцимом клетки были флуоресцентно окрашены различными концентрациями (1x, 2x, 10x и 100x) двух флуоресцентных красителей, агглютинина зародышей пшеницы (WGA) и Hoechst 33342. WGA [CF ^® 594 WGA, красный флуоресцентный краситель] использовался для селективного связывания с остатками пептидогликанового слоя клеточной стенки, а Hoechst 33342, синий флуоресцентный краситель, использовался для специфического связывания с нуклеиновыми кислотами двухцепочечной ДНК бактериальных клеток. Был использован стандартный метод подготовки образцов для флуоресцентной микроскопии. Для каждой комбинации лизоцима и красителя были изучены три поля. Для определения различий в концентрациях лизоцима был проведен однофакторный дисперсионный анализ. Значение p < 0,05 было отмечено как существенное различие. Структурная целостность клеточной стенки начала ухудшаться при 175 и 250 мкг/мл лизоцима, а лизис клеток и полосатость ДНК увеличились при концентрации 425 мкг/мл. Концентрация лизоцима 175 мкг/мл производила в среднем 41% протопласта или частичное переваривание клеточной стенки. Увеличение концентрации лизоцима от 175 до 250 мкг/мл привело к снижению среднего процента протопласта (4%). При концентрации 425 мкг/мл средний процент протопласта снизился до 1%, а также показал увеличение полосатости ДНК. При концентрации красителя 1x наблюдалось частичное окрашивание клеточной стенки. При 2x было зафиксировано полное окрашивание клеточной стенки. При 10x наблюдалось полное окрашивание клеточной стенки и ядер, аналогично концентрациям красителя при 2x без значительного насыщения красителей. Концентрация красителя в 100x вызывала перенасыщение красителей в клеточной стенке и ядрах, что приводило к их смешиванию и снижению эффективности идентификации бактериальных клеток и протопластов. 2x была наиболее оптимальной для полного окрашивания клеточной стенки и ядра. Фоновый флуоресцентный шум наблюдался по мере увеличения концентрации красителя. В Lactobacillus acidophilus концентрация лизоцима 175 мкг/мл была достаточной для переваривания клеточной стенки. Эффективность концентрации красителя была наилучшей при 2x с наименьшим количеством фонового шума.