Журнал противовирусных и антиретровирусных препаратов
Открытый доступ

Абстрактный

Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантных форм полноразмерного и внеклеточного домена гликопротеина EBOV в клеточных линиях млекопитающих

Мисаки Вайенгера, Пис Бабирье, Кэрол Мусубика, Сэмюэл Киримунда, Мозес Л. Джолоба

Предыстория: Полноразмерный гликопротеин вируса Эбола (GP) пронизывает внешнюю липидную мембрану, образуя шипы, где он опосредует взаимодействие вируса с клеткой-хозяином. Секреторная форма GP (sGP) также вырабатывается всеми 5 известными видами вируса Эбола . Эти свойства делают GP идеальной мишенью для исследований и разработок (НИОКР) вируса Эбола и, возможно, экспресс-диагностических тестов (RDT), биотерапевтических средств и вакцин, нацеленных на панфиловирус. Предшествующее клонирование рекомбинантного вируса Эбола Заира ( EBOV ) GP в основном использовало системы экспрессии насекомых ( бакуловирус ). Мы сообщаем о клонировании, экспрессии и очистке полноразмерных и внеклеточных доменных форм (ECD) рекомбинантного EBOV GP в клеточных линиях млекопитающих.

Методы и результаты: 2034 и 1956 пар оснований (п.н.), кодирующих последовательности ДНК, соответствующие 669 и 643 аминокислотным остаткам (а.о.) полной длины и ECD форм EBOV GP, были субклонированы в плазмиды pTGE. Рекомбинантные плазмиды pTGE использовались для трансфекции клеток млекопитающих 293-6E HEK, выращенных в бессывороточной среде экспрессии FreeStyleTM 293. Клеточные лизаты и/или супернатанты культур использовались для получения очищенного белка с последующим анализом на SDS-PAGE и вестерн-блоте. Очищенный полноразмерный GP был обнаружен как связанный с мембраной белок в клеточных лизатах с предполагаемой молекулярной массой ~100 кДа (кал. М. ~71,67 кДа) на вестерн-блоте; и 0,02 мг GP (концентрация: 0,2 мг/мл, чистота: ~50%) получены. Напротив, ECD GP был обнаружен в супернатантах бульона клеточной культуры с предполагаемой молекулярной массой ~116 кДа на основе SDS-PAGE и вестерн-блоттинга; и было получено 1,6 мг (концентрация: 0,4 мг/мл, чистота: ~70%) GP_ECD.

Заключение: В клетках млекопитающих рекомбинантный полноразмерный EBOV GP преимущественно экспрессируется как трансмембранный белок (tGP), тогда как ECD GP элюируется в культуральную среду. Обе рекомбинантные формы GP имеют решающее значение для R и D быстрых диагностических тестов (RDT).