Ферментная инженерия
Открытый доступ

Абстрактный

Разработка α-L-трансфукозидазы для синтеза фукозилированных HMO

Дора Молнар-Габор

Олигосахариды грудного молока (HMO) признаны полезными для грудных детей несколькими способами. В результате растет интерес к синтезу HMO, имитирующих их естественное разнообразие. Большинство HMO представляют собой фукозилированные олигосахариды. α-L-фукозидазы катализируют гидролиз α-L-фукозы с невосстанавливающего конца глюкана. Они относятся к семействам гликозидгидролаз GH29 и GH95. Фукозидазы семейства GH29 демонстрируют классический механизм удержания и являются хорошими кандидатами на трансфукозидазную активность. Недавно мы продемонстрировали, что α-L-фукозидаза из Thermotoga maritima (TmαFuc) из семейства GH29 может быть преобразована в эффективную трансфукозидазу путем направленной эволюции (Osanjo et al. 2007). В данной работе мы разработали полурациональные подходы к разработке α-L-трансфукозидазы, взяв за основу α-L-фукозидазу из комменсальных бактерий Bifidobacterium longum subsp. infantis (BiAfcB, Blon_2336). Эффективное фукозилирование было получено с помощью мутантов фермента (L321P-BiAfcB и F34I/L321P-BiAfcB), что позволило in vitro синтезировать лактодифукотетраозу, лакто-N-фукопентаозу II, лакто-N-фукопентаозу III и лакто-N-дифукогексаозу I. Ферменты также генерировали более сложные HMO, такие как фукозилированная пара-лакто-N-неогексаоза (Fp-LNnH) и моно- или дифукозилированная лакто-N-неогексаоза (F-LNnH-I, F-LNnH-II и DF-LNnH). Стоит отметить, что мутация в этих двух положениях не привела к сильному снижению общей активности фермента, что делает эти варианты интересными кандидатами для крупномасштабных реакций трансфукозилирования. Впервые в данной работе представлен эффективный ферментативный метод синтеза большинства фукозилированных ОГМ.