Ферментная инженерия
Открытый доступ
ISSN: 2329-6674
ISSN: 2329-6674
Камешвар Шарма YVR, Нилима Бура и Прасидхи Тьяги
Липазы являются вездесущими ферментами, которые катализируют гидролиз жиров в жирные кислоты и глицерин на границе вода-липид и обращают реакцию в неводных средах. Липазы занимают видное место среди биокатализаторов благодаря их новым и многогранным применениям в олеохимии, органическом синтезе, разработке моющих средств и питании. Липаза была извлечена и выделена из пищеварительного канала и пищеварительного тракта Catla catla (catla). Ткань была гомогенизирована в соотношении 1:3 с исходным буфером (0,01 М ТрисHCl, pH 7,2). Полученный таким образом сырой экстракт был осажден с использованием сульфата аммония (20-80%). Избыток соли был удален диализом, и полученный диализат (обессоленный фермент) был подвергнут колонке DEAE-Cellulose для ионообменной хроматографии со скоростью потока 0,5 мл/мин. Элюирование проводили ступенчатым градиентом NaCl (100-800 мМ) в исходном буфере. Активные фракции объединяли в очищенную фракцию (PF) и использовали для физической характеристики pH, температуры и влияния кальция на активность фермента, структурной характеристики, молекулярной характеристики и для кинетических исследований. Очищенная фракция (PF) показала конечную удельную активность 1438,72 ед./мг. Оптимальное значение pH составило 7,8, а оптимальная температура составила 20 °C. Значение температуры плавления (Tm) составило 42 °C, а энергия активации очищенной липазы составила 34,82 кДж/моль/K. Было обнаружено, что термическая стабильность липазы составляет 20 °C. Активность липазы сохранялась до 3 ч инкубации с 10 мМ и 20 мМ CaCl2 в исходном буфере. Это показывает, что кальций обладает свойством усиливать денатурацию фермента. Константа Михаэлиса-Ментен (Км) липазы из индийского большого карпа, catla для гидролиза pNPP составила 6,695 мМ. Число оборотов (kcat) липазы (catla) составило 0,0022 с-1. Каталитическая эффективность (kcat/Km) липазы составила 0,0003412 с-1 мМ-1. SDS-PAGE очищенной липазы (PF) выявил однородную одиночную полосу с молекулярной массой 70 кДа. Вторичное структурное расположение α-спиралей и β-нитей очищенной липазы дает 48,51% и 9,74% соответственно с использованием кругового дихроизма.