Передовые методы в биологии и медицине
Открытый доступ

Абстрактный

Метод локализации in situ одноцепочечных и двухцепочечных элементов РНК, содержащихся в 3'-нетранслируемой области генома вируса гепатита С

Элоди Рэнс, Цзин Ху, Джером Э. Таннер и Кэролайн Альфиери

Способность разрешать вторичные и третичные структуры, присутствующие в их нативном состоянии в геноме РНК-вирусов, является важным первым шагом в выяснении процесса репликации этих вирусов. Геном вируса гепатита С (HCV) состоит из одноцепочечной (+) РНК, репликация которой контролируется в первую очередь 3'-нетранслируемой областью (3'UTR). 3'UTR включает в себя специфичную для генотипа вариабельную область (VR), повтор поли (U/UC) и консервативную последовательность из 98 оснований , называемую X-хвостом. Хотя были предложены структурные модели 3'UTR из биохимического анализа in vitro, ее нативная структура как часть полноразмерного вирусного генома, существующего во внутриклеточной среде, не определена. В качестве средства картирования нативных двухцепочечных (ds) и одноцепочечных (ss) структур РНК, содержащихся в 3'UTR полноразмерного генома, мы провели химическое мечение in situ в сочетании с сайт-направленной ОТ-кПЦР. Результаты показывают, что ssRNA преобладает в последовательностях повторов VR-poly (U/UC), тогда как элементы dsRNA ограничены X-хвостом. Химическое мечение in situ также идентифицировало уникальный элемент dsRNA, расположенный в области повторов VR-poly (U/UC), включающей часть последовательностей, расположенных за пределами 3'UTR. Описанные здесь результаты представляют собой первый отчет по зондированию in situ и обнаружению вторичных структур, присутствующих в последовательности 3'UTR генома HCV. Использование агентов, модифицирующих внутриклеточную РНК, для разграничения двухцепочечной и одноцепочечной РНК в сочетании с ПЦР для амплификации следовых количеств целевой РНК имеет потенциальное применение для картирования нативных вторичных структур внутри сложных внутриклеточных РНК.