Журнал клинической и экспериментальной офтальмологии
Открытый доступ

Абстрактный

Стандартизация изоляции эндотелиальных клеток роговицы человека и использование оголенной амниотической мембраны человека в качестве каркаса для эндотелиальных клеток роговицы человека

Калпана Суреш, Алан Мэтью Паннуз, Сара Курувилла и Танви Кханна

Цели: Стандартизировать изоляцию эндотелиальных клеток роговицы человека (HCEC) и использовать оголенную амниотическую мембрану человека (HAM) в качестве каркаса для изолированных HCEC.
Методы: Амниотическую мембрану человека оголяли с использованием 1,2 ед./мл Dispase II при 37°C в течение 60 минут с последующим механическим соскабливанием. Листы эндотелия роговицы и десцеметовой мембраны снимали с глаз трупа человека-донора, непригодных для хирургического использования, и ферментативно расщепляли с помощью 2 мг/мл раствора коллагеназы II при 37°C и 5% CO2 в течение 2 часов. Изолированные клетки ресуспендировали в культуральной среде с добавками и высевали на непокрытую культуральную посуду на четыре часа для устранения фибробластов, которые прилипают быстрее, чем эндотелиальные клетки. После предварительной обработки неадгезивные клетки высевали на покрытые желатином чашки или на оголенную амниотическую мембрану в среде OptiMEM с добавлением факторов роста. Клетки анализировали с помощью микроскопии на адгезию и полигональную морфологию.
Результаты: Микроскопия оголенной амниотической мембраны не выявила остатков эпителиальных клеток. Ферментативное переваривание роговицы оставило бесклеточные десцеметовы листки с эндотелиальными клетками, плавающими по отдельности или в кластерах, с предварительной обработкой, способствующей более свободной от фибробластов изоляции эндотелиальных клеток. Немногим изолированным клеткам удалось закрепиться на амниотической мембране и сохранить эту адгезию во время последующих замен среды.
Заключение: Длительная обработка HAM с использованием мягкого фермента Dispase-II приводит к оголению мембраны, которая служит успешной основой для собранных эндотелиальных клеток роговицы. Этот подход может быть дополнительно изучен как экономически эффективная альтернатива для пролиферации эндотелиальных клеток и как in vitro модель для исследований тканевой инженерии роговицы.